重组蛋白在生物医药、生物技术等领域具有广泛应用。大肠杆菌因其生长迅速、培养条件简便、遗传操作易于实现以及可进行高密度发酵等特点，成为最常用的重组蛋白表达系统之一。然而，在实际生产过程中，大肠杆菌表达重组蛋白仍面临一系列挑战，如蛋白质折叠错误、缺乏翻译后修饰以及异源蛋白质的降解等。因此，优化大肠杆菌表达重组蛋白的发酵过程，提高重组蛋白的产量和活性，具有重要的理论和实际意义。

一、大肠杆菌表达重组蛋白的基本要素

1. 载体的选择

载体是将外源基因引入宿主细胞的工具，在大肠杆菌中，通常使用改良形式的质粒载体，如pBR322及其衍生载体。质粒载体需具备在宿主内自主复制的能力，且尺寸相对紧凑（小于10kb）。复制子决定质粒在宿主细胞中的拷贝数，直接影响外源基因的拷贝数和表达量。然而，质粒拷贝数的增加并不一定会提高重组蛋白的产量，因此需保持质粒拷贝数和重组蛋白产量之间的平衡。

启动子是驱动基因转录的关键元件，影响重组蛋白的生产。理想情况下，重组蛋白的表达应占细胞总蛋白的10%~30%，并且启动子的诱导过程应直接且经济高效。融合标签则通过基因重组技术将特定的蛋白、多肽或寡肽标签融合到目标蛋白的N端或C端，主要用于提高蛋白质的溶解性、稳定性或纯化效率。

2. 宿主菌株的选择

大肠杆菌菌株的选择对于重组蛋白的生产至关重要。K12和BL21菌株及其衍生变种广泛用于表达宿主。为了提高mRNA的稳定性、增强在细胞质中产生二硫键的能力以及严格控制外源基因的过度表达等特性，通过基因工程改造了不同类型的大肠杆菌菌株。

3. 培养条件的优化

大肠杆菌的培养条件对于重组蛋白的成功生产很重要。研究表明，通过优化培养条件如氧气供应、pH值、温度和营养成分，可以显著提高重组蛋白的产量。例如，调节氧气浓度可以控制乙酸盐的产生及其毒性；持续供应葡萄糖则有助于减少乙酸盐的生成。此外，自动诱导方法的发展也显著改善了外源基因的表达。

二、大肠杆菌表达重组蛋白的关键因素

1. 分子伴侣的作用

分子伴侣在蛋白质重组过程中起到重要作用，特别是防止包涵体的形成。重组蛋白过度表达时，分子伴侣可以与靶蛋白共表达，帮助重组蛋白在翻译过程中或翻译后正确折叠，减少包涵体的形成。大肠杆菌细胞质中的常见分子伴侣包括GrpE、GroEL、DnaK、GroES和DnaJ。

2. 二硫键的形成

二硫键的形成对于某些蛋白质的功能至关重要，然而在大肠杆菌中生产具有大量二硫键的蛋白质是一个挑战。细胞质内还原酶的存在以及过氧化物酶（如二硫键异构酶和二硫键氧化酶）的缺乏限制了二硫键的形成。为解决此问题，开发了Shufe和Origami大肠杆菌菌株，通过改变硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶基因，使细胞质成为适宜二硫键形成的环境。

3. 包涵体的处理

重组蛋白在大肠杆菌中的表达常以包涵体形式存在，这些包涵体通常无活性，并且常出现错误排列的二硫键。获得具有活性的蛋白质通常需要将包涵体进行分离、溶解、复性和纯化。减少包涵体形成的方法包括低温培养、选择合适的菌株、同时表达基因和伴侣蛋白以及调节pH等。

三、大肠杆菌表达重组蛋白的优化策略

1. T7 RNA聚合酶系统的优化

T7 RNA聚合酶系统因其高效转录能力而被广泛应用于大肠杆菌表达重组蛋白。然而，这种高效转录可能会导致宿主细胞负担过重，特别是在表达毒性蛋白时。因此，生产重组蛋白时，需要在T7 RNAP的转录和翻译之间取得平衡，以减少宿主细胞的压力，提高蛋白质产量。可以通过使用pET质粒表达重组蛋白和利用不同的启动子提高T7 RNAP转录和翻译的效率。

调节T7 RNAP的数量和活性也是有效控制重组蛋白表达的策略之一。研究表明，通过优化T7 RNAP的转录水平，可以显著降低毒性蛋白的生成压力。采用不同类型的诱导型启动子替代T7 RNAP启动子，能够精确调节转录水平，减少泄漏表达。

2. 营养物质的补充

在重组蛋白表达过程中，补充特定营养物质可以维持细胞活力和生产效率。某些氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、脯氨酸和苏氨酸，可以促进细胞生长，而丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和半胱氨酸则有助于提高蛋白质生产效率。通过抑制磷酸转移酶系统，可以减少葡萄糖摄取和乙酸生成，进而提高目标蛋白的表达效率。

3. 细胞生长与重组蛋白生产的解耦

在细胞培养初期，宿主细胞在正常的生长条件下培养，由于没有重组蛋白生产，所以不存在资源竞争。当细胞培养达到稳定状态后，停止生长并开始生产重组蛋白，优化资源利用效率。这一策略已在工业生产中得到广泛应用。

4. 发酵过程的优化

发酵过程的优化包括微生物细胞层面的优化和宏观微生物生化反应层面的优化。通过调整发酵罐的几何形状、供氧能力、菌体代谢特征、培养条件以及建立数学模型进行模拟与预测放大，可以实现对发酵过程的系统优化。

四、大肠杆菌表达重组蛋白的实际应用与挑战

大肠杆菌作为生产重组蛋白的首选平台之一，在生物制药和生物技术领域具有重要应用。然而，在实际生产过程中，仍面临一系列挑战，如蛋白质折叠错误、缺乏翻译后修饰、异源蛋白质的降解以及包涵体的形成等。因此，持续优化大肠杆菌表达系统，提高重组蛋白的产量和活性，是当前研究的重点。

五、结论

大肠杆菌因其独特的优势在重组蛋白表达领域具有广泛应用。本文探讨了大肠杆菌表达重组蛋白发酵过程中的关键点，包括载体选择、宿主菌株优化、培养条件调整以及表达系统调控等方面。通过优化这些关键因素，可以显著提高重组蛋白的产量和活性。未来，随着生物技术的不断发展，大肠杆菌表达系统将进一步优化和完善，为生物医药和生物技术领域提供更多高质量的重组蛋白产品。