核黄素（维生素B₂）的发酵生产主要通过微生物发酵工艺实现，常用的生产菌种包括**枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、阿舒假囊酵母（Eremothecium ashbyii）或基因工程改造菌株。以下是其详细工艺步骤：

1. 菌种选育与保藏

菌种来源：选择高产核黄素的菌株（如枯草芽孢杆菌的基因工程菌株）。

菌种改良：通过诱变（紫外、化学诱变）或基因工程技术（如过表达核黄素合成相关基因**rib**操纵子）提高产量。

保藏条件：菌种通常以冻干粉或甘油管形式保存于-80℃。

 2. 培养基配制

 种子培养基（用于菌种活化）：

 碳源：葡萄糖（10-20 g/L）、玉米浆（5-10 g/L）。

氮源：酵母提取物（5-10 g/L）、硫酸铵（2-5 g/L）。

无机盐：KH₂PO₄（1-2 g/L）、MgSO₄·7H₂O（0.5-1 g/L）、FeSO₄（0.01 g/L）。

 pH：6.8-7.2，灭菌条件121℃、20分钟。

发酵培养基（用于大规模生产）：

碳源：葡萄糖（初始30-50 g/L，后续补料）、玉米浆（20-30 g/L）。

氮源：豆粕水解液、酵母粉（10-20 g/L）。

前体物质：甘氨酸（1-2 g/L，促进核黄素合成）。

微量元素：Mn²⁺、Zn²⁺（微量）。

pH：6.5-7.0，灭菌条件同上。

3. 发酵工艺步骤

（1）种子培养

一级种子罐：接种量1%-2%（v/v），温度37℃，转速200-300 rpm，通气量1:0.5-1 vvm，培养12-16小时。

二级种子罐：放大培养至对数生长期（OD₆₀₀≈5-10），用于接种发酵罐。

（2）主发酵

接种量：5%-10%（v/v）。

温度控制：37℃（枯草芽孢杆菌）或28-30℃（酵母菌）。

pH控制：通过自动流加NH₃·H₂O或H₂SO₄维持6.5-7.0。

溶氧（DO）控制：通过调节搅拌转速（300-600 rpm）和通气量（1:1-2 vvm）维持DO≥30%。

补料策略：

  碳源补料：流加葡萄糖（维持残糖浓度5-10 g/L）。

 前体补加：甘氨酸或嘌呤前体（如次黄嘌呤）。

诱导时机：对数生长期后期（约12-18小时）诱导核黄素合成基因（如使用IPTG诱导重组菌）。

（3）发酵终点

发酵周期：48-72小时，当残糖≤1 g/L、菌体进入衰亡期时终止。

 核黄素产量：可达10-20 g/L（高产菌株）。

4. 下游处理

（1）发酵液预处理

离心或过滤：去除菌体及杂质（若核黄素分泌至胞外）。

酸/碱处理：调节pH至4.0-4.5（促进核黄素沉淀）。

（2）提取与纯化

结晶：发酵液浓缩后冷却结晶（核黄素在酸性条件下溶解度低）。

吸附与洗脱：使用活性炭或离子交换树脂吸附，再用乙醇-氨水洗脱。

重结晶：乙醇-水体系纯化，获得高纯度核黄素晶体。

（3）干燥与包装**

干燥：喷雾干燥或真空干燥（温度≤60℃）。

成品：黄色至橙黄色结晶粉末，纯度≥98%。

5. 质量控制

含量测定：HPLC法检测核黄素含量。

微生物指标：无菌检查、内毒素检测（若用于医药）。

理化指标：水分≤1%、炽灼残渣≤0.1%。

6. 关键工艺要点

1. 溶氧控制：核黄素合成需充足氧气，DO不足会导致副产物积累。

2. 前体补充：甘氨酸和嘌呤前体能显著提高产量。

3. 基因工程优化：过表达rib操纵子（ribG、ribB等）和敲除竞争途径基因（如黄素激酶）。

4. 防污染措施：严格灭菌，防止噬菌体或杂菌污染。

应用领域

医药：维生素B₂片剂、注射液。

食品工业：营养强化剂（如奶粉、谷物）。

饲料：动物饲料添加剂。