玻尿酸（透明质酸，HA）的微生物发酵工艺是目前工业化生产的主要方法，具有高效、可控、成本低等优势。以下是其发酵工艺的核心流程及技术要点：

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### **1. 菌种选择与优化**

- **常用菌株**：传统采用致病性链球菌（如兽疫链球菌），现多使用基因工程改造的**非致病性菌株**（如枯草芽孢杆菌、乳酸菌等），安全性更高。

- **基因工程改良**：通过过表达透明质酸合成酶（HasA）基因、敲除透明质酸降解酶基因（Hyaluronidase），提升HA产量和分子量。

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### **2. 发酵培养基**

- **碳源**：葡萄糖（主要）、蔗糖或乳糖，浓度需优化避免底物抑制。

- **氮源**：酵母提取物、蛋白胨、大豆水解物等，提供氨基酸和生长因子。

- **无机盐**：Mg²⁺（辅因子）、K⁺、PO₄³⁻（缓冲体系），调控渗透压和酶活性。

- **前体物质**：尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-GlcUA）前体（如谷氨酰胺）可促进HA合成。

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### **3. 发酵工艺参数**

- **分批/补料分批发酵**：补料分批工艺可延长产酸期，提高HA浓度（可达5-10 g/L）。

- **温度**：37℃（链球菌）或30-35℃（枯草芽孢杆菌）。

- **pH**：中性（6.5-7.5），通过自动流加NaOH/HCl调控。

- **溶氧（DO）**：链球菌需微好氧（DO 10%-30%），枯草芽孢杆菌需高氧（DO>50%）。

- **发酵时间**：48-72小时，根据菌株代谢特性调整。

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### **4. 代谢调控策略**

- **碳氮比（C/N）**：高C/N（如20:1）促进HA合成，低C/N促进菌体生长。

- **前体补充**：添加葡萄糖醛酸、乙酰葡糖胺前体物质，强化HA合成途径。

- **渗透压控制**：添加山梨醇、甜菜碱等渗透保护剂，维持细胞膜稳定性。

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### **5. 下游提取纯化**

1. **灭活与离心**：80℃热处理灭活菌体，离心去除细胞碎片。

2. **沉淀纯化**：乙醇或丙酮沉淀HA，去除蛋白质（可结合蛋白酶处理）。

3. **超滤分级**：截留不同分子量（10 kDa-4000 kDa），控制产品规格。

4. **干燥**：冷冻干燥或喷雾干燥，得到白色粉末状HA。

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### **6. 技术难点与解决方案**

- **染菌控制**：严格无菌操作，发酵罐CIP/SIP（在位清洗/灭菌）系统。

- **分子量调控**：通过溶氧、剪切力、发酵时间调节HA链长。

- **成本优化**：使用廉价碳源（如玉米浆）、回收发酵废液中的氮源。

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### **7. 行业进展**

- **合成生物学**：构建“细胞工厂”（如毕赤酵母、大肠杆菌），实现HA全合成。

- **连续发酵**：结合膜过滤技术，实现高密度连续生产。

- **绿色工艺**：酶法提取替代有机溶剂，减少环境污染。

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### **应用示例**

- **医药级HA**：超滤除热原，分子量>1000 kDa，用于眼科手术或关节注射。

- **化妆品级HA**：分子量50-300 kDa，通过水解酶降解获得小分子HA。

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通过优化菌种、工艺参数及纯化技术，现代发酵法可高效生产高纯度、不同分子量的透明质酸，满足医疗、美容等多领域需求。